［本站讯］近日，山东大学微生物改造技术全国重点实验室张友明教授团队在ACS catalysis期刊发表了题为“Functional and Mechanistic Investigation of a Distinct DUF6895 Family Epimerase Involved in Lasso Peptide Modification”的研究论文，山东大学助理研究员钟冠男，教授卞小莹、张友明，厦门大学冯柳宾为该论文的共同通讯作者；山东大学博士研究生时梦晗为本文第一作者。山东大学微生物改造技术全国重点实验室为第一完成单位。本研究揭示了DUF6895蛋白在套索肽生物合成中的催化功能与分子机制。

未知功能结构域（DUFs）蛋白是一类数量庞大但功能未知的蛋白，根据序列或结构特点分为不同的家族。研究表明，核糖体合成翻译后修饰肽（RiPPs）已成为研究DUFs蛋白催化功能和分子机制的有力工具，如最近发现的多核非血红素铁依赖型氧化还原酶MNIO（DUF692）、双核铜依赖型氧化酶（DUF3328）、以及钴胺素依赖型自由基SAM酶伴侣蛋白（DUF5825）等，拓展了对于DUF蛋白功能与催化机制的认知。本文作者对来自Streptomycessp. HP-A2021的套索肽基因簇shp展开深入研究，尤其是基因簇中DUF6895蛋白ShpE的功能与催化机制。

Shanhepeptins的生物合成途径

该团队通过基因簇异源表达分离得到一种含D-Phe及二羟基-Trp的新型套索肽天然产物shanhepeptin A。基因敲除实验表明，基因簇中的两个翻译后修饰酶：DUF6895蛋白ShpE和FAD依赖的单加氧酶（FMO）ShpF分别催化Phe10的差向异构和Trp2的双羟基化修饰。体外酶活实验证实，ShpE作为一种新型的差向异构酶催化前体肽底物ShpA中核心肽第10位Phe的差向异构化，该反应依赖先导肽但不依赖核糖体肽识别元件ShpB1蛋白。AlphaFold3结构模拟显示，ShpE可以同时结合ShpA的先导肽和核心肽，且ShpA的Phe10嵌入ShpE的疏水氨基酸口袋，其Cα两侧各有一对酸碱氨基酸残基（E48/ H281与E221/H176），上述四个位点突变后蛋白催化活性完全丧失，证实其为催化关键残基。DFT计算结果显示，ShpE通过E48/ H281与E221/H176残基以两步“酸碱”化学反应机制实现可逆的差向异构化。生物信息学分析显示ShpE及其同源蛋白与DUF6895蛋白家族的其它成员序列相似性较低，但上述关键催化残基（两对His/Glu）在该家族中高度保守，暗示大多数DUF6895家族成员可能以相同的分子机制催化差向异构反应。ShpF的体外测活实验进一步证实了该蛋白催化Trp2的双羟基化，且该反应严格依赖ShpE催化的差向异构反应。本研究是DUF6895蛋白的第一例功能与催化机制解析，拓展了套索肽的结构多样性以及对RiPPs差向异构的酶学认知。

本研究得到国家自然科学基金、山东省自然科学基金、山东大学青年学者未来计划、微生物改造技术全国重点实验室青年人才培育及揭榜挂帅等项目的资助。山东大学生命环境研究公共技术平台为本工作提供了重要支持。