［本站讯］近日，微生物改造技术全国重点实验室高翔教授团队在微生物学领域权威期刊Cell host & Microbe以长文形式在线发表题为“A conserved adaptor orchestrates co-secretion of synergistic type VI effectors in gut Bacteroidota”的研究文章，揭示了一种全新的T6SS多效应蛋白的共分泌机制，阐明了多效应蛋白通过酶活组合协同拮抗受体株的分子机制，为开发模块化效应蛋白以增强杀菌效果、拓宽杀菌谱，实现对肠道微生物组的靶向调节提供了新工具和理论基础。山东大学博士研究生李伟勋、郑帅宁为论文共同第一作者，高翔教授为该研究的通讯作者。微生物改造技术全国重点实验室为第一完成单位和通讯作者单位。广州慕恩生物科技有限公司蒋先芝，山东大学微生物改造技术全国重点实验室教授王明钰、胡玮、李盛英，北京生命科学研究所邵峰对本研究均有重要贡献。
人体肠道中存在着极为密集且多样化的微生物群落。肠道菌在肠道内争夺有限的资源与生态位，对人体的健康产生了广泛而深远的影响。菌间的拮抗和防御机制是它们主要的竞争方式之一。拟杆菌是人体肠道中丰度最高的革兰氏阴性菌。为了在菌间竞争中获取优势地位，肠道拟杆菌使用接触依赖型六型分泌系统(Type Six secretion system, T6SS) 作为对抗其他拟杆菌的抗菌武器。T6SS是一类重要的菌间拮抗武器，供体株与邻近受体株直接接触，并通过T6SS将效应蛋白注射至受体株内，从而发挥菌间拮抗作用，该作用已被证明在肠道菌群定殖于人体肠道方面发挥重要作用。T6SS广泛分布于革兰氏阴性菌中，且首次在变形菌门中被发现。由于缺乏序列相似性，拟杆菌门T6SS直至2014年才通过结构相似性检索被识别。目前，T6SS的研究主要聚焦于变形菌门，由于与已知蛋白的一级序列、结构域和motif缺乏相似性，识别和表征拟杆菌门T6SS效应蛋白的分泌机制和作用方式仍具挑战性。迄今为止，拟杆菌T6SS研究仅停留在生信分析、描述杀菌现象等层面，拟杆菌T6SS的详细结构、作用机制、递送模式及生态学意义尚不清楚，这极大地限制了对拟杆菌门高效定殖人体肠道机制的进一步理解。
针对以上研究不足，高翔团队在研究中发现，脆弱拟杆菌中存在一种独特的T6SS基因簇，该基因簇编码潜在双效应蛋白BtpeA和BtaeB。综合利用微生物学、生物化学、结构生物学、遗传学和生物信息学等研究手段，作者证明了双效应蛋白BtpeA和BtaeB的分泌相互依赖，并被VgrG共递送至受体株中。双效应蛋白的共递送机制是通过BtpeA-BtapC-BtaeB-VgrG的顺序性组装实现的。全新的辅助蛋白BtapC协调了双效应蛋白BtpeA-BtaeB复合物组装的过程，BtaeB的掺入进一步使得BtpeA能够被顺利加载至VgrG上，进而被T6SS递送出去。此外，BtpeA不仅是效应蛋白，还融合表达了T6SS必不可少的结构组分PAAR，因此BtaeB对BtpeA分泌的调节也间接调控了T6SS的活性。
图1 脆弱拟杆菌T6SS双效应蛋白基因簇
在多数T6SS中，效应蛋白的缺失对T6SS的活性无影响或影响较小，而在双效应蛋白BtpeA-BtaeB递送系统中，任一效应蛋白的缺失均会显著影响T6SS的活性。通过精巧的多效应蛋白负载检查点机制，该T6SS只有确认双效应蛋白同时加载才会启动递送过程，进而在一次注射中同时递送双效应蛋白。这一机制防止了T6SS成分的无效发射，从而节省了能量。因此，该研究提出了一种新型的效应蛋白依赖的T6SS分泌方式，即由效应蛋白调节T6SS的活性，通过负载检查点机制确保VgrG已经携带多个效应蛋白，进而被T6SS同时递送，该研究还提供了首个VgrG携带多效应蛋白负载的高分辨率结构。
图2 双效应蛋白共递送及协同杀菌机制概述图
此外，双效应蛋白BtpeA和BtaeB被共递送至受体株，使其以远超单效应蛋白活性总和（100倍）的菌间拮抗能力，协同赋予编码株适应性优势，凸显了双效应蛋白共递送的生物学意义。BtpeA和BtaeB的协同杀菌作用依赖于共递送机制及其酶活组合。效应蛋白BtaeB具有酰胺酶活性，靶向成熟肽聚糖，而效应蛋白BtpeA则具有磷酸酶活性，靶向肽聚糖前体Lipid II，进一步阻止受体菌受损肽聚糖层的修复，双效应蛋白协同发挥杀菌作用。这也是首次发现具有磷酸酶活性的T6SS效应蛋白。
图3 双效应蛋白共递送系统的潜在应用
作者进一步对这一类拟杆菌T6SS进行了全面的生物信息学分析，并由此揭示了一类具有代表性的拟杆菌门T6SS多效应蛋白基因簇。生物信息学分析表明，脆弱拟杆菌中超过一半的T6SS均采用BtapC介导的双效应蛋白递送机制。此外，位于可移动遗传质粒上的BtapC-associated T6SS，通过促进基因水平转移，使得这一类T6SS在拟杆菌中广泛传播，在拟杆菌门的进化中发挥了重要作用。这一类拟杆菌T6SS的特征在于高度保守的递送模块及多变的效应模块，这凸显了该类型T6SS的工程化潜力，通过替换效应蛋白的毒性结构域，可以实现具有不同抗菌活性的两种效应结构域的多种组合，以增强杀菌效果和/或拓宽杀菌谱，从而实现针对肠道微生物组的靶向调节。
上述研究工作得到了国家自然科学基金、国家重点研发计划、山东省自然科学基金等基金的资助。山东大学微生物改造技术全国重点实验室生命环境研究公共技术平台为本工作提供了重要技术支持。
